Переполнение формиата приводит к захвату токсичного фолата в раковых клетках, ингибированных MTHFD1

Природный метаболизм, том 5, страницы 642–659 (2023 г.) Процитировать эту статью

6644 Доступа

32 Альтметрика

Подробности о метриках

Раковые клетки подпитывают свою возросшую потребность в поставках нуклеотидов за счет усиления одноуглеродного (1C) метаболизма, включая ферменты метилентетрагидрофолатдегидрогеназа-циклогидролаза 1 и 2 (MTHFD1 и MTHFD2). TH9619 является мощным ингибитором активности дегидрогеназы и циклогидролазы как MTHFD1, так и MTHFD2, и избирательно убивает раковые клетки. Здесь мы показываем, что в клетках TH9619 нацелен на ядерный MTHFD2, но не ингибирует митохондриальный MTHFD2. Следовательно, выход формиата из митохондрий продолжается и в присутствии TH9619. TH9619 ингибирует активность MTHFD1, происходящую после высвобождения митохондриального формиата, что приводит к накоплению 10-формил-тетрагидрофолата, который мы называем «фолатной ловушкой». Это приводит к истощению тимидилата и гибели раковых клеток, экспрессирующих MTHFD2. Этот ранее не описанный механизм захвата фолата усугубляется физиологическими уровнями гипоксантина, которые блокируют путь синтеза пуринов de novo и дополнительно предотвращают потребление 10-формил-тетрагидрофолата для синтеза пуринов. Описанный здесь механизм захвата фолата для TH9619 отличается от других ингибиторов MTHFD1/2 и антифолатов. Таким образом, наши результаты открывают подход к борьбе с раком и раскрывают механизм регуляции метаболизма 1C.

Одноуглеродный (1C) метаболизм играет центральную роль в поставке нуклеотидов для синтеза и восстановления ДНК. Без достаточного количества нуклеотидов для удовлетворения пролиферативных потребностей клетки подвергаются остановке клеточного цикла или гибели клеток из-за репликационного стресса и геномной нестабильности1,2,3. Ферменты, участвующие в пути метаболизма 1C, обычно активируются при раке и производят нуклеотиды и аминокислоты, необходимые для быстрой пролиферации4,5,6.

Метаболизм 1С преимущественно обеспечивается заменимой аминокислотой серином, которая может образовываться из гликолитического промежуточного продукта 3-фосфоглицерата или поступать из внеклеточного пространства7. Катаболизм серина посредством фолат-зависимого метаболизма 1C необходим для синтеза нуклеотидов. Он опосредован четырьмя обратимыми ферментативными реакциями, протекающими в митохондриях и цитозоле (рис. 1а). Серингидроксиметилтрансфераза (SHMT) переносит гидроксиметильную группу от серина к тетрагидрофолату (THF) с образованием 5,10-метилентетрагидрофолата (CH2-THF) и глицина. Метилентетрагидрофолатдегидрогеназа-циклогидролаза (MTHFD) окисляет и гидролизует CH2-THF до 10-формилтетрагидрофолата (10-CHO-THF), который затем гидролизуется до THF и формиата формил-THF-синтетазой. В цитозоле эти реакции катализируются SHMT1 и трифункциональным MTHFD1, который состоит из двух отдельных доменов: домена дегидрогеназы-циклогидролазы (DC) и домена формил-ТГФ-синтетазы (FS). В митохондриях те же реакции катализируются SHMT2, бифункциональным MTHFD2 (активность DC) и MTHFD1L (активность FS) (рис. 1а)8. Хотя существуют вариации9, каноническая направленность пути следует за катаболизмом серина и окислением единицы 1C через митохондрии, в то время как цитозольные единицы 1C следуют восстановительным (обратным) путем, который обусловлен высоким цитозольным соотношением НАДФН:НАДФ+8,10,11,12. Таким образом, метаболизм 1С образует цикл, который распространяется между митохондриями и цитоплазмой. Благодаря обратимости реакций, катализируемых SHMT1 и MTHFD1, потеря митохондриального метаболизма 1C может быть компенсирована цитозольным путем13.

а — поток метаболизма 1С между митохондриями и цитозолем/ядром. b-e, кривые «доза-реакция» клеток SW620, обработанных в течение 96 часов TH9619 (b), TH9975 (c), DS18561882 (d) или SHIN1 (e) в присутствии 50 мкМ тимидина, 1 мМ формиата натрия или носителя ( культивирование в RPMI-FBS), означает ± стандартное отклонение (n = 3). f, скорость высвобождения формиата, полученного из серина, клетками SW620 WT, MTHFD2-/- и SHMT1-/-, обработанными в течение 24 часов указанными концентрациями TH9619 и TH9975 или 50 нМ MTX (культивированные в RPMI-FBS). , означает ± стандартное отклонение (n = 3 для контроля и TH9619, n = 2 для TH9975, n = 1 для MTX); однофакторный дисперсионный анализ (дисперсионный анализ) с использованием критерия множественных сравнений Тьюки. ж, Количественная оценка потенциала митохондриальной мембраны в клетках SW620 WT, обработанных 1 мкМ TH9619 или TH9975 или 0,5 мкМ MTX в течение 48 часов. FCCP использовали в качестве положительного контроля. Данные отображаются как средние ± стандартное отклонение (n = 4, n = 5 для FCCP); однофакторный дисперсионный анализ с критерием Даннетта для множественных сравнений. h,i, CETSA-анализ стабилизации MTHFD2 в клетках WT SW620, обработанных в течение 3 часов 10 мкМ TH9619 или носителем. Стабилизацию MTHFD2 оценивали с помощью вестерн-блоттинга путем нормализации оставшегося сигнала MTHFD2 на HSP60 во фракциях митохондрий (h) или на ламин A/C в ядерных фракциях (i). j, Репрезентативные иммуноблоты одного из двух независимых экспериментов. k, DARTS-анализ стабилизации MTHFD1 в лизатах SW620, которые инкубировали с 10 мкМ TH9619 или носителем в течение 30 минут, с последующим расщеплением белка при увеличении концентрации проназы и оценкой деградации MTHFD1 с помощью вестерн-блоттинга. Сигнал MTHFD1 нормализовали по SOD1. Показан представитель трех независимых экспериментов. l, средние значения pIC50 (-log половины максимальной ингибирующей концентрации) для указанных ингибиторов MTHFD1/2, оцененных по их ингибирующей активности против MTHFD1(DC) WT или мутанта MTHFD1(DC) (Q100A), среднее значение (слева направо n = 4, 9, 2, 19, 5, 15, 5, 6, 4, 8); непарный двусторонний t-критерий. м, кассета CRISPR-Select для MTHFD1-Q100A была доставлена ​​в клетки SW620. На графике показано соотношение MTHFD1-Q100A и WT на 2-й и 25-й день лечения 10 мкМ TH9619, нормализованное до значения 2-го дня, означает ± стандартное отклонение (n = 4); парный двусторонний t-критерий.