Скрининг не
ДомДом > Блог > Скрининг не

Скрининг не

Jun 05, 2023

Nature Communications, том 14, номер статьи: 5294 (2023) Цитировать эту статью

1 Альтметрика

Подробности о метриках

Saccharomyces cerevisiae — это «рабочая лошадка» промышленной биотехнологии благодаря известности этого организма в спиртовой ферментации и набору сложных генетических инструментов, доступных для управления его метаболизмом. Однако S. cerevisiae не подходит для перепроизводства многих массовых биопродуктов, поскольку токсичность ограничивает производство высоких титров. Здесь мы используем высокопроизводительный анализ для проверки 108 общедоступных штаммов дрожжей на толерантность к 20 г л-1 адипиновой кислоты (АК), предшественника нейлона. Мы идентифицировали 15 толерантных дрожжей и отобрали Pichia occidentalis для производства цис, цис-муконовой кислоты (СКК), предшественника АК. Разработав набор инструментов для редактирования генома P. occidentalis, мы демонстрируем периодическое производство CCM с максимальным титром (38,8 г л-1), выходом (0,134 г г-1 глюкозы) и продуктивностью (0,511 г л-1 ч-1). ), что превосходит все показатели, достигнутые с использованием S. cerevisiae. Эта работа приближает нас к промышленному биопроизводству АК и подчеркивает важность выбора хозяина в биопереработке.

Исторически пивные дрожжи (Saccharomyces cerevisiae) были предпочтительным микробным хозяином для перепроизводства топлива, химикатов и фармацевтических препаратов. Однако из-за низкой стоимости многих сыпучих химикатов и биотоплива концентрации, необходимые для производства в коммерческих масштабах, часто токсичны для S. cerevisiae и других модельных организмов. Например, S. cerevisiae не способен поддерживать рост при низких и умеренных концентрациях бутанола (2%)1, ванилина (0,05%)2, бензальдегида (0,1–0,2%)3 и многих органических кислот (0,25–2,5%). 4,5,6. Органические кислоты представляют собой особую проблему биопереработки, поскольку идеальный биопроцесс органических кислот должен осуществляться при кислом pH, что упрощает последующее восстановление недиссоциированной формы и позволяет избежать необходимости поддержания pH во время ферментации. Однако токсичность кислоты обратно пропорциональна pH, поскольку недиссоциированные кислоты (pH < pKa) свободно диффундируют в клетки и диссоциируют в цитозоле (pH 5–7)7. Соответственно, чтобы избежать токсичности продукта, культивирование большинства штаммов S. cerevisiae и других микробов, продуцирующих органические кислоты, проводится при pH > pKa8,9,10.

Адипиновая кислота представляет собой дикарбоновую кислоту C6, используемую при производстве нейлона 6,6. При годовом объеме производства в три миллиона тонн и мировом рынке в шесть миллиардов долларов США11 Министерство энергетики США классифицирует адипиновую кислоту как «супертовар»12. Глобальный спрос на адипиновую кислоту в настоящее время удовлетворяется с помощью химического процесса с участием циклогексана и азотной кислоты, но этот метод использует нефтехимические ресурсы и высвобождает закись азота, мощный парниковый газ, что побуждает к исследованию более устойчивых путей ее производства. Естественных путей биосинтеза адипиновой кислоты не существует, но предложено по крайней мере восемь инженерных биохимических путей ее биопроизводства11. Из этих путей наибольший прогресс был достигнут при использовании пути цис,цис-муконовой кислоты (CCM). В этой стратегии используются три гетерологичных фермента: 3-дегидрошикиматдегидратаза, декарбоксилаза протокатехиновой кислоты и катехолдиоксигеназа, для синтеза CCM из 3-дегидрошикимата, промежуточного продукта шикиматного пути. CCM превращается в адипиновую кислоту путем гидрирования ферментами еноат-редуктазой, однако бактериальные варианты, охарактеризованные на сегодняшний день, плохо функционируют в дрожжах-хозяевах13, достигая молярного превращения CCM в адипиновую кислоту <0,9%14. В отсутствие подходящей еноатредуктазы, активной для дрожжей, S. cerevisiae был сконструирован для синтеза CCM с титром, выходом и продуктивностью до 22,5 г л-1, 0,1 г г-1 глюкозы и 0,21 г л-1. h−1 соответственно9,10. Несмотря на эти достижения, процессы дрожжевого СКК выполняются при pH 5–6, что значительно выше рКа СКК (3,87) и сохраняет кислоту в диссоциированной форме, чтобы ограничить токсичность продукта.

1.0 in the allotted time in the absence of acid inhibitors./p>1.5 kb) were selected as loci for DNA integration in P. occidentalis. P. occidentalis promoters (0.6–1.5 kb) were identified by selecting the full sequence flanked by the target and upstream coding sequences. P. occidentalis terminators (0.3–1.2 kb) were identified by selecting the full sequence flanked by the target and downstream coding sequences. Pichia expression cassettes are provided in Table 5. Sequences of P. occidentalis promoters and terminators, and integration loci are provided in Supplementary Data 3 and 4, respectively. Genes and synthetic DNAs are provided in Supplementary Data 5./p>