Анаэробное окисление пропана в сочетании с восстановлением нитратов с помощью линии класса Symbiobacteriia.

Nature Communications, том 13, номер статьи: 6115 (2022) Цитировать эту статью

5840 Доступов

2 цитаты

23 Альтметрика

Подробности о метриках

Считается, что анаэробные микроорганизмы играют решающую роль в регулировании потока газообразных алканов с короткой цепью (КГК, включая этан, пропан и бутан) из наземных и водных экосистем в атмосферу. Было подтверждено, что сульфат действует как акцептор электронов, поддерживая микробное анаэробное окисление КЦГА, однако несколько других энергетически более выгодных акцепторов сосуществуют с этими газами в анаэробных средах. Здесь мы показываем, что биореактор, засеянный биомассой из очистных сооружений, может выполнять анаэробное окисление пропана в сочетании с восстановлением нитратов до газообразного диазота и аммония. Биореактор проработал более 1000 дней, и мы использовали эксперименты по мечению 13C и 15N, метагеномный, метатранскриптомный, метапротеомный и метаболитный анализы для характеристики микробного сообщества и метаболических процессов. В совокупности данные позволяют предположить, что за наблюдаемое нитрат-зависимое окисление пропана ответственен вид, представляющий новый порядок в бактериальном классе Symbiobacteriia. Закрытый геном этого организма, который мы обозначаем как «Candidatus Alkanivorans nitratireducens», кодирует пути окисления пропана до CO2 посредством присоединения фумарата и восстановления нитратов, при этом все ключевые гены экспрессируются во время нитрат-зависимого окисления пропана. Наши результаты показывают, что нитрат является важным поглотителем электронов для окисления SCGA в анаэробных средах, представляя новую микробно-опосредованную связь между циклами углерода и азота.

Значительное количество природного газа образуется из глубоководных отложений и выходов углеводородов на окраинах континентов и в наземных экосистемах1,2. Большая часть выбрасываемого природного газа потребляется микроорганизмами в бескислородных зонах, прежде чем газ диффундирует в кислородную среду и атмосферу3,4,5. Исследования анаэробного окисления природного газа были сосредоточены на сильном парниковом газе, метане, как на наиболее распространенном компоненте (~60–90%)6,7. Однако газообразные алканы с короткой цепью (КЦГА), включая этан, пропан, н-бутан и изобутан, также являются существенными компонентами природного газа (до ~20%)8 и важными предшественниками озона и органических аэрозолей9. Глобальные атмосферные выбросы ГКГА оцениваются в 9,2–9,6 Тг/год для этана, 9,6–10,5 Тг/год для пропана, 10 Тг/год для бутана и 4,2 Тг/год для изобутана10.

Анаэробное окисление метана (АОМ) широко изучено и относительно хорошо изучено7,11,12,13,14,15,16,17. Анаэробные метанотрофные археи (ANME) окисляют метан по пути обратного метаногенеза, включая ключевой комплекс метил-СоМ-редуктазы (MCR). ANME переносит электроны от метана к синтрофным сульфатредуцирующим бактериям (SRB)11,12 или непосредственно к восстановлению нитратов и оксидов металлов13,14,15,16. Бактерия Candidatus Mmethylomirabilis oxyfera осуществляет АОМ по «внутриаэробному» пути окисления метана, используя нитрит в качестве единственного акцептора электронов17. Микроорганизмы, вероятно, также связывают окисление SCGA с восстановлением этих акцепторов электронов в бескислородных условиях18. 'Ка. Было показано, что M. oxyfera' способна окислять этан и пропан посредством метанмонооксигеназы, хотя еще предстоит доказать, поддерживают ли эти источники углерода рост19. На сегодняшний день сульфат является единственным поглотителем электронов, который поддерживает анаэробное окисление SCGA20,21,22,23,24,25. Изолят дельтапротеобактерии Desulfosarcina aeriophaga BuS5 окисляет пропан и бутан по пути присоединения фумарата, образуя алкилзамещенные сукцинаты, процесс, опосредованный алкилсукцинатсинтазой (ASS)20,21, и напрямую восстанавливает сульфат до сульфида. Было обнаружено, что обогащение археи Candidatus Syntropoarchaeum активирует бутан посредством образования бутил-коэнзима M, процесса, катализируемого дивергентными MCR, с восстанавливающими эквивалентами, направляемыми к синтрофным партнерам SRB23. Аналогично, анаэробное окисление этана было связано с родственным Candidatus Argoarchaeum ethanivorans, который также кодировал MCR-подобный комплекс и, как предполагалось, образует синтрофные отношения с SRB22. Однако археи, способные опосредовать анаэробное окисление пропана, непосредственно связанное с восстановлением сульфатов, еще не идентифицированы.

90% and >70% bootstrap values, respectively. The scale bars indicate amino acid substitutions per site. b A composite fluorescence micrograph of the enrichment culture hybridized with the SYMB-1018 FISH probe (Cy3, red; targeting ‘Ca. A. nitratireducens’) and stained with DAPI (blue; all microbial cells). ‘Ca. A. nitratireducens’ cells appear magenta (blue + red). The scale bar indicates 20 μm. The representative image was selected based on the visual assessment of six separate hybridisation experiments. Consistent results were also obtained independently with two additional probes targeting the ‘Ca. A. nitratireducens’ population (Supplementary Fig. 8). c, d Relative expression of each genome and unbinned contigs, and microbial metabolism of interest for the genomes in the bioreactor. The total transcripts per million (TPM) was calculated for each gene. Genome sets with overall expression of total TPM > 1% are shown (c). KEGG annotation was used to identify ORFs coding for denitrification (M00529) and dissimilatory nitrate reduction to ammonium (M00530) pathways (d). Source data are provided as a Source Data file./p> 147.2) of the enriched culture extracts (n = 3, taken at various time points) revealed a peak at retention time 10.832 min, matching the peak of the iso-propylsuccinate standard. b A peak at retention time 11.078 min (ion transition, m/z: 289 > 147.1), corresponding to the peak from the propylsuccinate standard, was observed for cell extracts from the enriched culture (n = 3 at different sampling points). c Phylogenetic relationship of ‘Ca. A. nitratireducens’ AssA (Red) to other AssA and BssA in the NCBI database. Three AssA subunits (AssA123) found in ‘Ca. A. nitratireducens’ MAG formed a separate cluster. Bootstrap values >90% are shown as black dots on branch nodes. Scale bar represents amino acid substitutions per site./p> 147.2) and propylsuccinate (m/z: 289 > 147.1) standards were detected in the cell extracts (Fig. 4a, b). These findings support the hypothesis that ‘Ca. A. nitratireducens’ activates propane through homolytic C-H bond cleavage at both primary and secondary carbon atoms, and with addition of fumarate, yields propylsuccinate and iso-propylsuccinate. In addition, iso-propylsuccinate (5.96 nM) was more abundant than propylsuccinate (2.33 nM) in the culture extracts, suggesting the secondary carbon atom activation generating iso-propylsuccinate is the main route of propane oxidation (Fig. 5)./p> Q5. Among them, 12 million reads were longer than 1000 bp with read N50 of 6,135 bp. Adapters were trimmed using Porechop v0.2.4 (https://github.com/rrwick/Porechop)./p> 30 was selected and mapped to the KEGG Orthology database. The eggNOG v5 database was searched against using emapper 2.1.5 in diamond mode. Conserved motif(s) present within the predicted genes related to propane oxidation and nitrogen metabolism were further verified using NCBI’s conserved domain search62. Annotated KO numbers were used for inferring the pathway encoded in each genome. Pathways were identified as ‘not expressed’ if missed blocks > 75% when total blocks > 5, or missed blocks > 1 when total blocks ≤ 5./p>92% similarity), the probes were designed against the 16 S sequence of ‘Ca. A. nitratireducens’ and care should be taken in their application beyond well characterised systems. Given there are no cultured representatives available for probe validation, three FISH probes were designed to target different sites on the ‘Ca. A. nitratireducens’ 16 S rRNA to give higher confidence in their specificity. These included the SYMB-1018 (5ʹ - CCG AAG CCC AGC AAA CTC T − 3ʹ), SYMB-624 (5ʹ- TTC GCA AGC ACT CCC GCA – 3ʹ) and SYMB-186 (5ʹ - TCC TCC CGT CCC CAT GC – 3ʹ) probes. Unlabelled helper probes78 were designed to target the flanking regions of each probe site to increase accessibility to the target site for optimal fluorescent signal (SYMB-1018: H1, 5ʹ - ATT TCT AGA GCG GTC AGG GGA TGT − 3ʹ; H2, 5ʹ - CAC CTG TCT CCC TGT CTG GA − 3ʹ; SYMB-624: H1, 5ʹ - GTT AAG CTG CGG GTT TTC ACT CAC − 3ʹ; H2, 5ʹ - CTG CCC TCA AGC CCA ACA GT − 3ʹ; SYMB-186: H1, 5ʹ - GGC CGT GAG CAT ATC CGG TAT TAG C − 3ʹ; H2a, 5ʹ - GAC CCA TCC CGA AGC AGT AAA CCT T − 3ʹ; H2b, 5ʹ - GAC CCA TCC CGA AGT AGC AAC CCT T − 3ʹ). Helper probes were applied in equimolar amounts with their respective probe. The 5ʹ and 3ʹ ends of the oligonucleotide FISH probes were labelled with the Cy3 fluorophore and were synthesized by Integrated DNA Technologies, Singapore. A higher signal was achieved for these FISH probes with lysozyme pre-treatment of the biomass (0.5 mg ml−1 in 0.05 M EDTA, 0.1 M Tris-HCl, pH 8) for 30 min at room temperature. The Non-EUB nonsense probe was used as a negative hybridization control79. DAPI (1 ng/µl) staining of cells was performed for 15 min in the dark. The labelled biomass was visualized with a Stellaris5 white light laser confocal microscope (Leica, Germany)./p>